(株)ユーグレナ【2931】の掲示板 2019/06/14〜2019/07/06

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ミドリムシでの高効率ゲノム編集に成功
～バイオ燃料生産などに向けた有用ミドリムシ育種へ期待～

株式会社ユーグレナ
理化学研究所

　理研環境資源科学研究センターバイオ生産情報研究チーム の野村俊尚研究員、持田恵一チームリーダー、科技ハブ産連本部バトンゾーン研究推進プログラム微細藻類生産制御技術研究チームの鈴木健吾チームリーダーらの研究チームは、ミドリムシの産業利用種Euglena gracilis [1]を対象とした高効率のゲノム編集[2]方法の確立に初めて成功しました。
　本研究成果は、ミドリムシの基礎研究の推進や、有用株の育種に大きく貢献すると期待できます。
　ミドリムシは、食品やバイオ燃料への応用が進められている有用な微細藻類です。しかし、その基礎研究や有用株育種を進める上で重要である効率的なゲノム編集法は、これまで確立されていませんでした。
　今回、研究チームは、ミドリムシ細胞にCas9 RNP複合体[3]を直接導入する手法を用いて、最適な条件を見いだすことにより、約80 ％という非常に高い編集効率で標的遺伝子への欠損・挿入変異導入に成功しました。さらに、2種類のCas9 RNP複合体を用いたDNAの特定領域への長い欠損変異の導入や、一本鎖のドナーDNA分子を用いた正確な外来DNA分子の導入も可能であることを明らかにしました。
　本研究は、英国の科学雑誌『Plant Biotechnology Journal』の掲載に先立ち、オンライン版（5月26日付け）に掲載されました。

１．背景

　近年、持続可能性と経済活動を両立するバイオエコノミーの実現や、持続可能な開発目標（SDGs）[4]の達成に向けて、微細藻類を用いたバイオ燃料やバイオプラスチックなどの有用物質生産技術の開発が期待されています。
　なかでも、屋内外での大量培養法が確立されているミドリムシの産業利用種Euglena gracilis（以下、ミドリムシ）は、好気条件下において、バイオプラスチックの材料や機能性食品となる貯蔵多糖パラミロン[5]を蓄積します（図1）。一方、嫌気条件下では、パラミロンからワックスエステルと呼ばれる油脂を産生します。ワックスエステルはジェット機燃料に適しており、現在、実用化に向けた試験が進められています。また、ミドリムシは栄養価が高く、世界的に需要が拡大しつつある飼餌料としても注目されています。このような背景から、ミドリムシを利活用するための生物学的知識の集積と、有用形質を持った改変株の作出が求められています。
　しかし、実用的かつ持続的なミドリムシの遺伝子機能改変法は、まだ確立されておらず、それが基礎研究や効率的な育種を行う上での妨げとなっていました。そこで、研究チームは、将来的な産業利用の可能性も踏まえて、実用途に即したゲノム編集方法の確立を目指して研究を開始しました。

２．研究手法と成果

　研究チームはまず、ミドリムシのパラミロン合成に関わる酵素の遺伝子EgGSL2 [6]を標的としたガイドRNA（gRNA）[3]を設計し、標的DNAの切断活性を持ったCas9 RNP複合体を作製しました。次に、パラミロン粒の形態変化やT7E1 assay法[7]を指標とし、エレクトロポレーション法[8]を用いて、ミドリムシ細胞内にCas9 RNP複合体を直接導入するための最適な諸条件を探りました
　
その結果、アンプリコンシークエンス解析[9]による評価において、Cas9 RNP複合体を導入後72時間で約80 ％という、他の微細藻類では類を見ないほどの高効率でのランダムな欠損・挿入変異導入に成功しました。

また、ゲノム上の離れた位置を標的とする2種類のCas9 RNPをミドリムシの細胞内に同時に導入することで、長い欠損変異を誘発できました。さらに、Cas9 RNP複合体と一緒に、標的配列部位上下流と相同な配列を両端部に付加したをドナーDNAとしてミドリムシの細胞内に導入することで、正確な小規模のノックイン[11]にも成功しました。

３．今後の期待

　本研究では、他の微細藻類では類を見ないほどの高い効率で、ミドリムシにおけるDNAフリーゲノム編集手法の確立に成功しました。さらに、上記の高効率なゲノム編集法をベースに、ssODNを用いた効率的なノックイン実験にも成功し、より正確に制御されたミドリムシゲノムの改変も可能となりました。
　今後、本技術を駆使することにより、ミドリムシにおける遺伝子機能の解析などの基礎研究の推進に加え、有用物質生産能を向上させた株の分子育種や目的に応じてデザインしたミドリムシの作出が可能となると期待できます。
　また本研究は、国際連合が2016年に定めた17項目の「SDGs)」のうち…

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ミドリムシでの高効率ゲノム編集に成功
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